Присоединение молекул сахара к белкам является одной из наиболее распространенных модификаций белка, встречающихся во всех сферах жизни. Сахара, присоединенные к белкам, называются гликанами и модулируют физико-химические и физиологические свойства белков-носителей. 1 , Но отслеживание и визуализация гликоформ - специфических паттернов сахаров, прикрепленных к белку - в клетках является сложной задачей, особенно если вы хотите визуализировать несколько разных гликоформ одновременно. Пишу в Анжвандте Хеми Li et al . 2 Теперь сообщите о методе для этого, который основан на динамическом взаимодействии набора кодов ДНК.

С начала 1990-х годов использование флуоресцентных меток в качестве меток для белков революционизировало то, как клеточные биологи анализируют движение и локализацию белка в клетках. 3 , 4 , Но даже несмотря на то, что типы гликанов, прикрепленных к белкам, могут влиять на их перемещение и локализацию, было трудно визуализировать какую-либо конкретную гликоформу. Один из способов, с помощью которого исследователи пытались решить эту проблему, заключается в использовании метода, называемого флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET). В этом методе флуоресцентная молекула (флуорофор) присоединяется к интересующему белку, а второй флуорофор присоединяется к определенному сахару; флуоресценция происходит только в том случае, если две молекулы находятся в непосредственной близости через присоединение сахара к белку 5 - 8 , Однако необходимость использования двух разных флуорофоров может ограничить применение, например, затрудняя обнаружение нескольких гликоформ белка в одном и том же эксперименте.

Li et al. Преодолеть эту проблему, используя подход, который они описывают как стратегию иерархического кодирования, в которой несколько одноцепочечных молекул ДНК используются в качестве идентификационных кодов для визуализации специфических сахаров, прикрепленных к выбранному белку (рис. 1). Первая молекула ДНК, используемая в системе авторов, содержит последовательность (известную как аптамер), которая специфически связывается с целевым белком. Аптамер присоединен к другой последовательности (код белка), которая идентифицирует белок. Вторая молекула ДНК, называемая временным кодом, содержит последовательность, которая дополняет код белка, и поэтому гибридизуется с ней (образует двойную спираль).

Рисунок 1 | Способ визуализации сахаров на белках 2 , а , последовательность ДНК (код белка) связана с белком-мишенью через последовательность, называемую аптамером. Белковый код гибридизуется (образует двойную спираль) со второй последовательностью, называемой временным кодом. Сахар, присоединенный к белку, ковалентно присоединен к ДНК «шпильки», которая содержит замаскированную последовательность, которая идентифицирует сахар (код моносахарида). б , добавлена ​​«декодирующая» молекула ДНК, которая гибридизуется с временным кодом (не показан), высвобождая белковый код, так что он гибридизуется с частью шпильки. Шпилька открывается, разоблачая моносахаридный код. с , добавлена ​​вторая шпилька ДНК, которая дополняет код моносахарида; он также имеет флуоресцентную молекулу (флуорофор) на одном конце и молекулу-гаситель на другом, которая дезактивирует флуоресценцию. Шпилька гибридизуется с ДНК, содержащей моносахаридный код, открывая шпильку и позволяя флуорофору флуоресцировать. Белковый код одновременно подвергается воздействию этого процесса и может участвовать в другом цикле реакций.

Третья молекула ДНК, используемая в системе Ли и его коллег, содержит три сегмента. Первый сегмент дополняет код белка. Это связано со второй последовательностью, называемой моносахаридным кодом, который идентифицирует определенный сахар. Третий сегмент имеет последовательность, которая позволяет полной цепи сформировать структуру, известную как шпилька, которая маскирует код моносахарида. ДНК-шпилька ковалентно связана с сахаром, идентифицированным моносахаридным кодом. Если сахар, несущий шпильку, в свою очередь прикреплен к целевому белку, это может привести к тому, что шпилька окажется в непосредственной близости с двойной спиралью, образованной белком и временными кодами.

Последний ключевой компонент системы Ли и его коллег - еще одна заколка ДНК, которая содержит комплементарную последовательность к моносахаридному коду и последовательность, которая может вытеснить белковый код из двойной спирали. Шпилька также имеет флуорофор, прикрепленный на 5ʹ конце, и молекулу «гасителя» на 3ʹ конце. Гаситель предотвращает флуоресценцию флуорофора при закрытой шпильке, но допускает флуоресценцию при открытии шпильки.

Итак, как все эти компоненты взаимодействуют, чтобы декодировать ключевые идентификаторы ДНК и позволить визуализировать гликоформы? Процесс запускается, когда в систему добавляется одноцепочечная ДНК, которая дополняет временной код. Эта ДНК гибридизуется с временным кодом, вытесняя и обнажая белковый код. Открытый белок код затем гибридизуется с комплементарной последовательностью в шпильке, прикрепленной к сахару, открывая шпильку и демаскируя моносахаридный код.

Когда в систему добавляется шпилька, несущая флуорофор, немаскированный код моносахарида гибридизуется с последовательностью комплементарной ДНК в этой шпильке. Шпилька, следовательно, открывается, позволяя ее флуорофору флуоресцировать: в действительности, к сахару была прикреплена флуоресцентная метка, позволяющая его обнаружить. Гибридизация также демаскирует код белка, делая его доступным для следующего цикла реакции. Ключевым элементом системы Ли и его коллег является то, что код белка физически связан с целевым белком, потому что это гарантирует, что только сахара, несущие шпильки, которые прикреплены или близки к белку, могут стать флуоресцентными.

Авторы подтвердили, что цепочка реакций происходит в бесклеточной системе in vitro, и использовали ее для идентификации двух гликоформ белка MUC1: MUC1, украшенного сахарной фукозой или другим сахаром, называемым сиаловой кислотой. Важно отметить, что авторы также показали, что флуоресцентные сигналы могут генерироваться и обнаруживаться на клетках, которые были модифицированы с использованием метода, известного как метаболическая маркировка 9 включить шпильки с сахаром.

Преимущество этого метода состоит в том, что, поскольку выбор последовательностей ДНК, которые можно использовать в качестве меток, практически бесконечен, можно представить множество различных гликоформ, если белки и сахара могут быть специально помечены своими собственными кодами ДНК. Более того, авторы ясно показали, что сиалилированный и фукозилированный MUC1 могут быть одновременно обнаружены с использованием их метода. Одно потенциальное ограничение, однако, заключается в том, что использованная ДНК не наблюдалась для транспортировки в клетки посредством естественных процессов, что позволяет предположить, что внутриклеточные гликоформы не могут быть обнаружены этим методом. Это на самом деле может быть преимуществом для исследований, которые сосредоточены на белках клеточной поверхности.

Несколько вопросов необходимо будет уточнить в будущих исследованиях. Например, эффективность процесса декодирования неясна. Также не известно, могут ли сахара на молекулах рядом с белками-мишенями иногда становиться флуоресцентными в результате гибридизации ДНК между кодом белка и шпильками, прикрепленными к сахару на соседних белках. Поскольку к MUC1 присоединено большое количество гликанов, способ может не требовать высокой эффективности для генерации детектируемого флуоресцентного сигнала для этого белка, и любые мельчайшие сигналы, генерируемые соседними молекулами, не будут серьезной проблемой. Тем не менее, дальнейшие эксперименты с использованием других гликопротеинов, которые содержат меньше сахара, необходимы для полной проверки метода.

Учитывая, что обе вышеуказанные проблемы могут в значительной степени зависеть от длины используемых цепей ДНК, тщательный дизайн кодов ДНК и аптамеров будет иметь важное значение для обеспечения специфического обнаружения других гликоформ. Практические преимущества и недостатки нового метода по сравнению с другими стратегиями визуализации гликоформ, о которых сообщалось в последние несколько лет, включая два метода, о которых сообщали работники из той же группы, что и Li et al . 10 , 11 - также предстоит изучить.

Тем не менее, стратегия иерархического кодирования Ли и его коллег для визуализации гликоформ показывает большой потенциал и может стать важным шагом в разработке системы, аналогичной использованию зеленых флуоресцентных белков для мечения белков, что в настоящее время является стандартной практикой для биологов. Конечная цель состоит в том, чтобы визуализировать гликоформы таким образом, чтобы мы могли видеть то, что мы хотим видеть, а не только то, что можно увидеть.

Подпишитесь на ежедневную новостную рассылку Nature Briefing

Будьте в курсе того, что имеет значение в науке и почему, отобранных из Природы и других публикаций по всему миру.

Подписаться

Похожие